以α-甲基-色氨酸为内标物

以α-甲基-色氨酸为内标物，液相幼儿建立了碱水解-高效液相色谱法测定婴幼儿配方乳粉及特殊医学用途婴儿配方食品中色氨酸含量的色谱食品方法。样品经碱溶液水解，内标C18柱分离，法测荧光检测器检测；内标法定量，定婴校正水解过程色氨酸的配方损失，降低基质之间的中色差异，提高定量结果的氨酸准确性；在常见样品含量水平加标，样品的含量回收率为92.5%~97.4%之间，相对标准偏差<3.11%，液相幼儿实验室间偏差＜6.7%。色谱食品方法操作简单、内标准确度高，法测重复性好，定婴适用于婴幼儿配方乳粉及特殊医学用途婴儿配方食品中色氨酸的配方准确定性定量。

色氨酸是人体的必需氨基酸之一，参与机体蛋白质的合成和代谢调节，它是烟酸、5-羟色胺、褪黑激素等生物活性物质的前体物，影响蛋白质、糖类和脂肪等营养物质的代谢。当人体缺乏色氨酸时会引起皮肤疾患、玻璃体退化及心肌纤维化等病症。相较于成人，婴幼儿时期生长发育迅速，在该时期色氨酸及其代谢物对大脑的发育和对进食-饱足、睡眠-觉醒规律等神经行为调节发展至关重要，因此必须保证婴儿食品中营养素的含量和质量。对于消化吸收障碍、代谢紊乱或特定疾病状态的儿童对营养素或膳食有更为特殊的需求。

婴幼儿配方乳粉和特殊医学用途婴儿配方食品作为特定人群的食物来源，其营养成分组成在国家标准中都有特殊规定，对色氨酸的含量和添加形式都有相关的要求，但缺乏相应的检测方法标准。目前，测定色氨酸的检测方法有包括分光光度法、电化学法、氨基酸分析仪法、高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法和离子色谱法等，液相色谱方法的特异性和定量准确性均有优势。色氨酸多以蛋白质的形式存在于样品中，需水解为游离态后才能测定。目前通常采用的碱水解方法长时间在高温、高浓度碱液条件下进行，色氨酸有一定损失，且在不同的基质中色氨酸的损失程度不完全一致。

本研究在经典碱水解方法的基础上引入结构与色氨酸相似的内标物α-甲基色氨酸，以内标法定量，使同一水解条件同时适用于婴幼儿配方乳粉和特殊医学配方婴幼儿配方食品（乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方和氨基酸配方）中色氨酸含量的准确测定。

1材料与方法

1.1 材料与试剂

色氨酸标准品（C11H12N2O2，CAS号：73-22-3，纯度：99.7%），德国Dr.Ehrenstorfer公司；α-甲基-色氨酸标准品（C12H14N2O2，CAS号：110117-83-4，纯度：98%），上海甄准生物科技有限公司；甲醇(色谱纯)，美国Merck公司；醋酸铵（色谱纯），美国Fisher Chemical公司；乙酸（色谱纯），Fisher Chemical公司色；氢氧化锂（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；盐酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；聚四氟乙烯材质水解管，带螺纹口外盖，内衬聚四氟乙烯密封垫；水相微孔滤膜（0.22 μm，上海安谱）；NIST配方乳粉质控样1849a（（184±10）mg/100g, k=2）、NIST配方乳粉质控样1869（（228±24）mg/100g, k=2）、婴幼儿配方乳粉和特殊医学配方婴幼儿食品（乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方和氨基酸配方），均为市售。实验室用水符合 GB /T 6682 规定的一级水要求。

1.2标准溶液配制

色氨酸标准溶液（100 μg/mL）：准确称取10.0 mg色氨酸标准品用水溶解后定容至100 mL；内标工作液（1 mg/mL）：称取10 mg α-甲基-色氨酸标准品用水溶解后定容至10 mL。

1.3仪器与设备

Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪配有荧光检测器，美国Thermo Fisher公司；KQ-800DE超声清洗仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；MS204TS电子天平，瑞士梅特勒公司；DHG-9243BS-Ⅲ电热干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；MS 3 basic涡旋混合器，德国IKA公司；IQ 7000超纯水仪；美国 Millipore 公司。

1.4样品前处理

准确称取混合均匀的固体试样200 mg（精确到1 mg）于配有密封垫的具塞螺纹口聚四氟乙烯离心管中，依次加入0.5 mL内标工作液、5 mL氢氧化锂溶液（4 mol/L），涡旋混匀后于超声波振荡器中震荡5 min，保证样品完全溶解后，置于110 ℃烘箱中水解20 h。取出水解管，待冷却至室温后，用盐酸溶液（4 mol/L）调pH值至3~8，将水解液全部转移至50 mL容量瓶中并用水定容，混匀后经0.22 μm水相微孔滤膜过滤备用。

1.5仪器条件

色谱柱：Xbridge C18(3.5 μm, 150 mm×4.6 mm)；流动相：A为乙酸铵溶液（10 mmol/L，pH =4.0），B为甲醇，梯度洗脱，洗脱程序见表1；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL；荧光检测器激发波长280 nm，发射波长346 nm。梯度洗脱程序见表1，每次进样前初始流动相比例平衡5 min。

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